Bioethanol Generasi Kedua: Hydrolysis Enzymatic Biomassa Lignoselulosa

Tulisan ini berdasarkan pengalaman mempraktekkan  protokol dari NREL (National Renewable Energy Laboratory) USA, semoga bermanfaat untuk yang sedang penelitian bioethanol selulosa.

NREL menerbitkan dua metode hydrolysis enzymatic, pertama di LAP — dan kedua di Lap … Protokol pertama menjelaskan prosedur untuk menghidrolysis secara enzymatik biomassa lignoselulosa. Di protokol yang kedua sebenarnya sama saja prinsipnya, namun di prosedur ini lebih ditujukan untuk pengujian potensi biomassa lignoselulosa untuk memproduksi ethanol.

Hidrolisis enzimatis untuk pengujian digestibiliti biomassa lignoselulosa. Prosedur kerja utamanya adalah seperti ini:

*)Ini bukan manual/protokol lengkap, kalau mau yang lebih lengkap silahkan baca sendiri di protokolnya NREL.

1. Bahan-bahan yang digunakan:
• – biomassa yang sudah diketahui kadar total solid (%) dan kandungan selulosanya, atau kandungan glucannya. Alternatif analisa selulosa bisa baca di Analisa Lignin, Selulosa, Hemiselulosa.
• enzyme untuk menghidrolisis, bisa menggunakan selulosa, beta glukosidase, dan xylanase. Enzime ini harus sudah diketahui aktivitas. Misalnya berapa FPU/mL. Jika diperlukan enzyme bisa diencerkan dengan buffer sitrat.
• buffer sitrat 0.1 M pH 4.8.
• antibiotik, misalnya sodium azide 2%.
2. Tempat hidrolisnya bisa menggunakan erlenmeyer 50 mL atau sejenisnya.
3. Total volume reaksinya adalah 10  mL atau 10 g.
4. Biomassa yg dihidrolisis sebanyak 0.1 g selulosa atau 0.15 g biomassa. Ini adalah massa kering (odw:oven dry weight), jadi waktu menimbang mesti dikoreksi dengan berat airnya (cara mudah, bagi dengan total solid).
5. Dosis enzyme bisa bervariasi tergantung perlakuan. Misalnya: 5, 30, atau 60 FPU/g selulosa.  Bisa juga dihitung FPU/g biomassa. Dari dosis ini bisa dihitung berapa volume enzyme yang mesti ditambahkan ke dalam erlenmeyer.
6. Antibiotik zodium azide 2% yang dipakai cuma sedikit 0.1 mL.
7. Kemudian dihitung berapa penambahan buffer sitratnya. Volume buffer yang ditambahkan adalah :

= volume total – volume antibiotik – vol enzyme – berat biomassa yang ditambahkan

8. Pertama masukkan dulu biomassanya, trus buffer dan antibiotik. Enzyme jangan ditambahkan dulu.
9. Letakkan erlenmeyer di waterbath dengan suhu 50oC, dan dishaker 100rpm.
10. Setelah kira-kira suhunya sudah 50oC, baru enzymenya ditambahkan. Waktu hidrolisis dihitung ketika penambahan enzyme.
11. Lama hidrolisis adalah 72 jam. Untuk menghentikan hidrolisis, erlenmeyer direbus selama 5 menit.

Gula hasil hidrolisis bisa dianalisa dengan menggunakan HPLC. Alternatifnya bisa pakai glucosa kit atau paling tidak metode DNS.

Rumus menghitung digestibiliti:

Glucan hasil hidrolisis = konsentrasi glukosa (g/mL) x 10 mL x (160/180)

Digestibiliti (%) = (glucan : (berat sampel x total solid x kandungan selulosa)) x 100%

Biomassa yang dihidrolisis dalam protokol ini rendah, cuma sekitar 1% saja. Konsentrasi biomassa yang rendah untuk menghindari penghambatan enzyme oleh glukosa. Dan mengurangi pengaruh inhibitor kalau ada.

****

Hidrolisis enzymatis untuk produksi bioethanol prinsipnya sama saja. Perbedaannya terletak pada konsentrasi biomassa yang digunakan, yaitu 6% selulosa, atau bisa lebih tinggi lagi. Jika akan dilanjutkan ke fermentasi, jangan menggunakan antibiotik. Insya Allah akan saya tuliskan juga lain kali.