ANALISA AKTIVITAS ENZIME LIGNINOLITIK (revised)

Download manual ini dalam format pdf: Metode Analisa Enzyme Ligninolitik
Lihat juga metode dari Sigma Aldrich : Peroxidase Assay

Download buku dan referensi lain: Klik Di Sini.


Baca metode penelitian dari jurnal kadang-kadang bisa membuat pening kepala. Apalagi ketika baru pertama mau mulai dan tidak punya dasar-dasarnya. Bisa tidak mudheng sama sekali. Sama seperti saya waktu pertama kali mau analisa enzyme, mesti buka-buka texbook dan catatan lama, plus tanya sana-sini. Setelah itu baru sedikit ngeh. Saya bagikan prosedur ini untuk temen-temen yang mungkin membutuhkannya. Metodenya tidak mesti persis sama seperti yang saya uraikan di sini, yang penting tahu apa yang dilakukan dan bisa menghitungnya. Semoga bermanfaat.


Catatan:

Beberapa hal yang perlu diperhatikan pengukuran aktivitas enzyme.
1. Ekstraksi enzyme dan analisa mesti dilakukan pada hari yang sama. Aktivitas enzyme bisa cepat berubah jika disimpan. Jika Anda akan mengukur aktivitas enzyme ligninolitik, mesti segera dilakukan setelah ekstraksi enzyme. Penyimpanan dalam lemari pendingin atau dibekukan akan menghasilkan aktivitas enzyme yang berbeda.

2. Resep di bawah ini bisa saja dimodifikasi dengan mengatur komposisinya agar absorbansinya di antara 0 dan 1. Jika absorbansinya lebih dari 1, encerkan larutan enzymenya.

3. Waktu jeda analisa juga bisa disesuaikan dengan kebutuhan. Waktu bisa dikurangi atau ditambah hingga data absorbansinya cukup terbaca antara 0 dan 1.

A. Ekstrasi Enzyme

Ekstraksi Enzym dengan metode sentrifugasi (Gassara, Brar et al. 2010):
1. Satu gram sample dicampur dengan buffer phosphate 50mM pH 6,5 dengan perbandingan 10/1 (v/w).
2. Kemudian dishaker pada kecepatan 150 rpm selama 1 jam.
3. Setelah itu sampel disentrifugasi pada kecepatan 7000xg selama 20 menit.
4. Supernatan cair dipisahkan dan digunakan untuk analisa aktivitas enzyme.

Metode ini bisa dimodifikasi, langkah ke-2 diganti dengan digerus pada kondisi dingin. Pengerusan dilakukan dengan mortar dan letakan es disekitar mortar tersebut.Hasil gerusan kemudian disaring dan filtratnya disentrifugasi seperti cara di atas.

B. Pengukuran Aktivitas Enzyme

B.1. Laccase (Lac)

Pada cuvet masukkan:
– 0,5 buffer asetat pH5 0,5 M
– 0,1 ml ABTS 1 mM
– 0,4 ml filtrate enzim
Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur.
Reaksi aktvitas enzyme dilakukan pada suhu 20±1 oC.
Absorbansi diukur pada waktu 0 dan beberapa menit (5 atau 10 menit, atau lebih lama lagi) pada panjang gelombang  420 nm.

Rumus perhitungan:

Aktivitas enzyme (U/ml) = (∆OD420 x Vtot (ml) x 10^9)/(εmax x d x Vol enzyme (ml) x t)

ε maks = absorpsivitas molar ABTS (36000 M-1 cm-1)

B.2. Manganese peroxidase (MnP) (Yoshida, Yonehara et al. 1996)

(A) Pengukuran pada penambahan Mn:
Pada tube 2 ml. masukkan:
– 0,1 buffer lactate pH4,5 50 M
– 0,1 ml guaiakol 4mM
– 0,2 ml MnSO4 1mM
– 0,3 ml aquades
– 0,1 ml H2O2 1 mM
– 0,2 ml filtrate enzim
Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur.
Reaksi aktvitas enzyme dilakukan pada suhu 20±1 oC.
Absorbansi diukur pada waktu 0 dan (5 atau 10 menit, atau lebih lama lagi) pada panjang gelombang  465 nm

(B) Pengukuran tanpa penambahan Mn:
Pada tube 2 ml. masukkan:
– 0,1 buffer lactate pH4,5 50 M
– 0,1 ml guaiakol 4mM
– 0,5 ml aquades
– 0,1 ml H2O2 1 mM
– 0,2 ml filtrate enzim
Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur.
Reaksi aktvitas enzyme dilakukan pada suhu 20±1 oC.
Absorbansi diukur pada waktu 0 dan 30 menit pada panjang gelombang  465 nm

Rumus perhitungan:

Aktivitas enzyme (U/ml) = (∆OD465 x Vtot (ml) x 10^9)/(εmax x d x Vol enzyme (ml) x t)

ε maks = absorpsivitas molar Guaiakol (12100 M-1 cm-1)

Aktivitas MnP adalah aktivitas pada penambahan Mn dikurangi aktivitas enzyme tanpa penambahan Mn.

Alternatif metode pengukuran enzyme MnP
(Fujian, Hongzhang et al. 2001):

Pada tube/cuvet 2 ml dimasukkan:
– 1.70 ml sodium tartrate buffer pH 3.0 (0.24 mol/L)
– 0.2 ml filtrat enzyme
– 0.05 ml H2O2 (0.016 mol/l)
– 0.05 mL MnSO4 (0.40 mol/l)
Volume total 2 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur.
Absorbansi diukur pada waktu 0 dan (5 atau 10 menit, atau lebih lama lagi) pada panjang gelombang  240 nm.
Satu unit aktivitas enzyme MnP didefinisikan sebagai penambahan 0.1 dari ∆ OD240nm per menit.

MnP juga bisa diukur dengan menggunakan Phenol Red sebagai substrat (Kachlishvili, Penninckx et al. 2005).

B.3. Pengukuran Aktivitas Lignin Peroksidase (LiP)

Pada tube 2 ml. masukkan:
– 0,1 ml veratil alcohol 8mM
– 0,2 ml buffer asetat 50 mM pH3
– 0,45 ml aquades
– 0,05 ml H2O2 5 mM
– 0,2 ml filtrate enzim
Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur.
Reaksi aktvitas enzyme dilakukan pada suhu 20±1 oC.
Absorbansi diukur pada waktu 0 dan (5 atau 10 menit, atau lebih lama lagi) pada panjang gelombang  310 nm.

Aktivitas enzyme (U/ml) = (∆OD310 x Vtot (ml) x 10^9)/(εmax x d x Vol enzyme (ml) x t)

εmax : absorpsivitas molar Veratril alkohol (9300 M-1 cm-1)

Advertisements

16 responses to “ANALISA AKTIVITAS ENZIME LIGNINOLITIK (revised)

  1. Assalamu’alaikum wr.wb..
    pak isroi saya tika yang sebelumnya pernah bertanya di blog bapak juga sebelumnya.
    oia pak saya mau nanya lagi, waktu bapak melakukan assay enzim lignin apakah bapak membuat kurva standarnya juga?
    dan jika saya boleh tahu saat pengujian JPP penghasil ligninase nya itu produk akhirnya apa ya pak? misalkan jika subtrat xilan berikatan dengan enzim yg dihasilkan (xilanase) maka akan membentuk produk berupa xilosa, sedangkan untuk lignin apa ya pak?
    dan pak isroi melakukan assay enzim nya setiap brpa kali sehari ya?
    ditunggu ya pak balasannya di email saya :
    tika_triyana@ymail.com

    Terimakasih ^_^

    • Wa’alaikum salam.
      1. Tidak perlu membuat kurva standardnya. Pakai hukum Beer-Lambert untuk menghitung aktivitasnya.
      2. Tergantung enzyme apa yg diukur dan substrat yang digunakan. Ada sedikit penjelasnanya di jurnalnya Wong 2009.
      3. Saya lakukan analisa sesuai kebutuhan. Tidak setiap hari.

  2. hukum Beer-Lambert itu seperti apa ya pak?
    saya boleh mengetahui referensinya?
    Terimakasih..

  3. oia pak kalo buat assay enzim lignin itu harus spesifik ya? jika untuk assay enzim lignin secara umum tidak bisa ya?
    misalkan untuk assay enzimnya menggunakan substrat murni lignin (hsl ekstraksi dari kayu) mka itu bisa apa tidak pak?

  4. assalamu’alaikum wr wb..
    pak isroi maaf mau saya mau nanya lagi. kalo rumus perhitungan di atas ada 10 pangkat 9, itu darimana ya pak?
    mohon balasannya. terimakasih.
    wassalam ^_^

  5. assalamualaikum pak, maaf saya mau tanya , cara pembuatan buffer lactate pH 7 itu bagaimana ya pak, terima kasih sebelumnya… 🙂

  6. assalamu’alaikum pak isroi, saya mau tanya pengukuran aktivitas enzyme laccase di atas sumbernya dr jurnal apa ya pak..? terimakasih sebelumnya..

  7. bapak, maaf saya mau tanya, untuk metode pengukuran aktivitas enzim laccase sumber referensinya dari jurnal apa ya pak.. terimakasih..

  8. assalamualaikum..
    pak isroi perkenalkan saya ricky susanto putra, mahasiswa aktif semester 8 FATETA, IPB.
    ingin bertanya pak, kebetulan penelitian TA saya tentang degradasi lignin secara enzimatik. sebelumnya saya ingin menguji enzim yang dihasilkan secara kualitatif dengan menggunakan media ligninase berdasarkan zona bening yang terbentuk.
    ada beberapa pertanyaan terkait penelitian kami tersebut, yang mungkin bapak dapat membantuk untuk menyelesaikannya.
    apakah bapak memiliki bahan-bahan untuk pembuatan media ligninase tersebut ya pak?
    bagaimana dengan komposisi media tersebut pak?
    dari beberapa review jurnal yang telah saya baca, pembuatan media tersebut menggunakan bahan Poly R-478 dye (sigma) yang sangat sulit saya dapatkan.
    terima kasih pak sebelumnya.
    wassalamualaikum.

  9. Pak Isroi, saya Rosita, sedang penelitian tesis tentang purifikasi enzim selulase. ketika melakukan uji kativitas enzim, saya menggunakan buffer asetat 20mM pH 5 dengan menggunakan substrat alkali ekstrak tandan kosong kelapa sawit dan juga substrat CMC. yang ingin saya tanyakan, bagaimana saya menghitung aktivitas enzimnya? nilai regresi yang saya peroleh dari standart adalah 0.976 dengan rumus y=0.0067x+0.0023. waktu inkubasi 2 jam, volume enzim 0.5 mikro liter. Terimakasih

  10. Selamat malam, maaf mengganggu pak isroi.
    Bukan bermaksud mau jualan tapi cuman mau saling membantu saja. Nama saya sepwin, saya penelitian mengenai aktivitas enzim ligninolitik. Saya menggunakan veratril alkohol sbg substrat buat enzim lip. Saya tidak menggunakan zat tersebut lagi. Bagi yang mau mengukur aktivitas enzim lip dng substrat veratril alkohol bisa hubungi saya melalui email sepwinnostensitompul@yahoo.co.id
    Veratril alkoholnya saya peroleh dari jepang. Saya mahasiswa biologi di usu, medan.
    Thanks in advance.

  11. Bapak saya mau tnya. Apakah semua perhitungan aktivitas enzim lacase, MnP dan LiP dengan dasar jurnal apapun rumus perhitungannya sama seperti ini (∆OD x Vtot (ml) x 10^9)/(εmax x d x Vol enzyme (ml) x t)??
    Lalu saya mau tnya
    1. d itu apa ya pak?
    2. Apakah t itu waktu?
    3. V tot itu apakah volume dari komposisi yg saya buat atau yg saya masukkan kuvet??
    4. Volume enzime itu volume dari komposisi??
    Makasih njeh pak

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s